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新闻详情

关于FFPE样本检测,你了解多少?

FFPE(Formalin-fixed paraffin-embedding)样本是医学领域常见的生物材料。此类样本已经被广泛应用于高通量测序、原位杂交、免疫组织化学等研究领域。目前,全球约有数亿FFPE组织样本,这些组织样本已经是疾病诊断和科学研究的最为宝贵的的生物学资源之一。

随着基因组学检测技术的快速发展,尤其新一代测序技术(NGS)的飞速发展,在细胞分子水平提供了前/所未有的检测能力,研究人员可以使用这一技术手段对FFPE样本进行研究,寻找与疾病相关的基因突变。

FFPE样本的制备
1.样本的采集:组织固定前的操作时间应当越短越好,以避免基因表达改变、组织自溶等变化
2.
福尔马林固定:组织的固定使用的是福/尔马林溶液。将组织放到一定浓度的福/尔马林溶液中,使核酸之间、蛋白质之间、以及核酸和蛋白质之间产生一定程度的交联,固定时间越长,交联程度越大
3.
石蜡包埋:福尔马林固定之后,需要用石蜡将组织进行包埋,其包括四个主要步骤:脱水,透明,浸蜡和包埋在固定和包埋之后,FFPE样品最好应在最佳温度下保存,这样可减缓核酸和蛋白的降解

从FFPE样品中提取出的核酸和蛋白的质量取决于固定和包埋之前、期间和之后如何处理样品,样本如果未处理好,会造成核酸严重片段化,我们需要对处理后的样本进行质控,以便后续开展核酸提取和测序等下游应用。

FFPE样本核酸提取
FFPE样本的DNA品质会显著影响后续荧光定量或者二代测序文库的构建成功率和测序数据指标。所以从FFPE样本中提取出高质量的DNA,尤为重要。
通常,FFPE样本核酸提取实验包括以下流程:样本切片、脱蜡和水化、蛋白酶K组织消化、基因组DNA的纯化、核酸提取。

样本切片:石蜡样本在提取前需要进行切片处理,一般需要5-6个切片,一片镜检确定肿瘤细胞含量,其他进行后续提取处理,切片的薄厚程度对后续观察和提取会有一定影响
脱蜡和水化:因为FFPE样本的特殊性,石蜡会阻碍消化液对组织的渗透,从而抑制蛋白酶K和组织内蛋白的接触,影响到组织消化和核酸的释放。为消除石蜡对DNA提取和PCR扩增的不良影响,必须组织进行彻底的脱蜡
蛋白酶K组织消化:为了将DNA与结合的蛋白质分离,FFPE样本需经受高温和蛋白酶K消化。蛋白酶K可以消化蛋白质组分以及样品中可能存在的任何核酸酶,这个步骤还可防止DNA发生降解。注意要把握好消化时间,可以根据组织类型、组织大小进行调节,使DNA充分释放
基因组DNA纯化:FFPE样本中核酸和蛋白质是紧密交联在一起的,进行组织消化后样品已经变成水化状态,此时需要进行震荡解交联,释放DNA用于后续纯化。如果可能的话,因交联而引起的化学修饰也应当逆转,因为化学修饰的DNA不能在纯化过程中高效回收,而且在PCR或其他酶学分析中是一个不佳的底物,在断裂交联和逆转化学修饰时必须小心,因剧烈的反应条件可能导致DNA的进一步片段化
核酸提取:根据不同的研究目的选取相应的方法提取DNA,常用的有酚氯/仿抽提法、柱膜法、磁珠法等等

由于FFPE样品很珍贵,所以只有有限的材料可用于下游分析。菁良FFPE标准品能够助于FFPE提取流程性能确认和试剂盒提取效率性能验证,确保能够高效地从FFPE样品中回收可分析的生物分子。

FFPE样本的二代建库注意细节
对FFPE样本提取出来的DNA进行质控
在建库前需要先对DNA进行质检,主要检测DNA的总量(浓度)、完整性以及纯度。DNA的建库起始投入量不足、DNA有降解、存在杂质污染等这些因素会影响建库的成功率以及后续测序数据的表现。所以,浓度测定一定要准确,目的是保证建库投入量的准确性。电泳检测DNA如果有降解的话,需要根据降解程度来适当调整后续DNA的打断时间。如果存在蛋白质、RNA等杂质污染的话,需要用蛋白酶K、RNA酶等进行消化、纯化处理。目的都是为了在建库前了解DNA的质量,一方面可以提前采取措施提高建库的成功率,另一方面当后续实验或者测序数据指标出现问题时可以更好的追溯原因。

打断前损伤修复
FFPE样本在制备和保存过程中会使得基因组DNA发生一定程度的损伤,比如缺口、胞嘧啶脱氨基为尿嘧啶等,为了提高文库质量,建议将DNA先用特定的酶混合物进行修复,然后再进行打断

打断时间
FFPE样本由于保存环境以及时间的不同,提取出来的DNA会发生不同程度的降解,所以在打断的时候,打断循环数(也就是打断时间)需要根据DNA的降解程度进行调整,使打断后片段峰值尽量集中在预期的范围之内


由于样本降解等因素可能会造成建库困难、建库产量低、文库测序质量差等问题,影响后续突变检出率,菁良FFPE标准品还可助于FFPE建库效率质控,解决“假阴性”问题

FFPE样本检测中诸多挑战
虽然测试平台经常会校准,使用的样本也是经过校准的,但是实际操作中的样本经常会面临很多意想不到的挑战。FFPE 样本出现的问题是固定过程和存储条件均会造成大量的DNA损伤,从其中提取出来的DNA质量一般都比较差,主要体现在以下方面:

  1. DNA总量少

  2. 在FFPE样本的制备过程中,组织经福尔马林固定、石蜡包埋时很容易引起DNA的降解,长期的储存也会导致核酸进一步降解

  3. 在将FFPE样本中的组织进行脱蜡分离时使用的脱蜡试剂,也会导致核酸再次降解

  4. 组织消化不彻底会严重影响DNA的得率

  5. 存在C>T/G>A等碱基替换造成检测结果的假阳性

  6. 脱蜡试剂残留会干扰后续建库实验

DNA损伤的变异数量和类型,如果忽略,可能会对最终结果产生负面影响,这对下游应用比如测序的影响是巨大的:从简单测序文库构建的失败到虚假文库的产生,最终导致结果的错误。


菁良解决方案

高通量测序技术的不断进步降低了可靠检测测序突变的频度阈值, 如何从FFPE样本中获得高品质的适合NGS分析的DNA变得异常关键,而在测序项目开始时正确评估每个样本的质量也至关重要。
针对FFPE样本在研究中面临的难点,菁良提供了系列模拟临床样本的FFPE标准品,主要以供:

  1. FFPE样本质量质控

  2. FFPE提取流程性能确认

  3. FFPE提取试剂盒提取效率性能验证

  4. FFPE建库效率质控

  5. FFPE PCR/NGS检测结果验证


FFPE标准品

▷FFPE蜡块或切片
▷样本来源于人类细胞系,最/大程度模拟患者FFPE样本
▷数字PCR平台验证变异位点
▷产品包含DNA及RNA两种形式
▷包括ALK,ROS1,RET,NTRK等融合基因
▷突变来源于非小细胞肺癌NCCN指南推荐的基因

肿瘤融合FFPE标准品


▷兼容主流监测平台:PCR,NGS
▷覆盖常见热门伴随诊断融合基因:ALK,RET,ROS1,NTRK1,NTRK3等
▷含DNA及RNA层面的融合
▷可用于基因融合检测Panel的性能验证、日常质控、室间质评、DNA及RNA提取效率的验证等