菁良基因设计10款gDNA肿瘤检测标准品
联合16家国内知名生物科技公司进行标准品测试
标准品监控肿瘤基因检测机构的检测能力并助其校正检测流程
基因检测缺乏标准、流程不规范是导致检测结果不可靠的主要因素。目前全球范围内都缺乏国际化、统一、公认的标准体系。面对全球以及中国市场的强大需求，菁良基因在2018年设计生产了10款gDNA肿瘤检测标准品，这些标准品均来源于人类癌症细胞系，等位基因突变频率从1%到25%，包含cfDNA及gDNA两种形式，涵盖了中国市场十余种肿瘤靶点基因突变。
2018年9月份，菁良基因联合16家国内知名生物科技公司，进行了Onco SNV Multiplex gDNA 标准品 （表一）的测试。通过这次测试，大家可以了解到标准品是如何监控肿瘤基因检测机构的检测能力并助其校正检测流程的。
本次测试选取了菁良基因自主生产的Onco SNV Multiplex gDNA 标准品，其设计突变位点及对应的突变频率见表一。
表一 Onco SNV Multiplex gDNA 标准品基因突变位点及对应的突变频率
9月份，菁良联合16家业内知名生物科技公司，对标准品进行测试。这16家公司基本涵盖了市场上常用的测序平台。
表二 16家企业选用的检测平台
结果
我们将同一原材料，统一生产及QC生产出的8ug gDNA分装成16管标准品，分给上述16家客户，10个位点 AF检测结果如图一。
图一 16家客户的测试AF分布图
如图所示，16家公司10个位点的的不同突变频率检测结果用16种不同的颜色表示，横坐标表示参考AF，纵坐标表示16家公司实际测得的AF，其中14家AF检测结果均与参考AF相差无几, 都处在误差范围内。公司B测得的60%的位点AF在误差范围外，公司F测得的30%的位点AF远低于参考AF，提醒B，F 两家公司急需修正检测流程，公司N检测的PIK3CA E545K的AF结果远低于误差下限，提醒该客户注意该点的探针设计或者算法设置。
从上图我们同样可以看出，用作测试的该标准品10个突变位点AF检测结果都集中在45度线上，表示大部分客户的检测结果接近参考值，显示GW标准品的稳定性，高重复性和精确度，可以作为独立的参考标准来检测各平台差异。
我们从16家结果中随机挑选了一家公司A，分析它的检测结果和参考AF的一致性。结果如下图所示：
图二 客户A的检测结果和参考AF的一致性
上图横坐标表示标准品10个突变位点的参考AF，纵坐标表示客户A检测的标准品对应突变位点的AF。红色和黄色虚线分别代表对应的参考AF误差范围上下限。
从上图可以看出，该公司检测出来的标准品10个位点中，80% AF检测值在误差范围内，只有两个位点检测结果在误差限外，经核对，上述两个位点分别为EGFR ΔE746 - A750和PIK3CA H1047R。建议该公司选用同一标准品，多做几次重复实验，来验证这两个点出现异常的原因，考虑重新设计这两个位点的PCR探针或者优化NGS算法中这两个点的计算法则。
我们收集了每个位点所有16个公司的数据，来观察哪些位点本身会导致检测结果有比较大的偏差。下图为标准品其中一个位点 EGFR G719S的检测AF在16家公司的分布图。
图三 EGFR G719S AF分布图
图三中的横坐标代表16家公司名称，分别用字母替代。纵坐标代表实际测得的AF。此位点参考突变频率是24.5%，允许的误差范围为正负10%，结果显示有三个公司的测试结果落在误差限外。
观察其余9个位点的检测AF分布情况，我们发现：随着突变位点参考AF的下降，测试结果的准确度也随之下降。
提醒那些检测结果超出检测限的公司，需要修正检测流程，以提高检测灵敏度。在每个位点的AF分布图中，都有远超出检测限的数值，提醒这些公司需要留意流程的准确性。
结论
16家公司不同平台的Onco SNV Multiplex gDNA标准品检测结果表明，菁良基因标准品具有高重复性和高精确度，可以作为独立的参考标准检测各平台的差异，并能用于客户的日常质控，检测下限探测，检测流程精确度和灵敏度等工作。
